En 2015, as tesoiras moleculares CRISPR Cas9 foron consideradas o maior avance científico do ano. Desde entón, esta ferramenta usouse no laboratorio para cambiar ou editar pezas do ADN dunha célula, con numerosas aplicacións terapéuticas. Cinco anos despois, as codescubridoras desta tecnoloxía recibiron o Nobel de Química por este achado. Esta semana, nun salto adiante para a enxeñería xenética, un equipo de investigadores de EE.UU. e Xapón descubriron un novo método —máis preciso e potente, segundo os seus creadores— para recombinar e reorganizar o ADN de forma programable. Os resultados publícanse en dous estudos da revista Nature.
No primeiro deles, desvélase esta nova clase de sistemas biolóxicos programables. O ARN ponte é o primeiro exemplo dunha guía de ARN específica, capaz de recoñecer e unirse simultaneamente a secuencias de ADN diana e doante. “Esta propiedade única permítenos non só inserir, senón tamén eliminar e investir de forma programable dous fragmentos calquera de ADN utilizando un único mecanismo unificado”, explica a SINC Patrick Hsu, autor principal do traballo e investigador do Instituto Arc (Pau Alto, EE.UU.).
“Aínda que a recombinación ponte representa un avance significativo máis aló das capacidades de corte de ADN e ARN de anteriores tecnoloxías e achéganos a un conxunto completo de capacidades de deseño do xenoma, é pronto para comparalo cos sistemas CRISPR altamente optimizados”, engade o experto. “Iso si, os nosos resultados iniciais en células bacterianas son prometedores. Demostramos unha eficacia de inserción entre o 60% e o 90% dun xene desexado en células bacterianas, dependendo do ARN ponte utilizado. Tamén conseguimos unha especificidade de inserción superior ao 94% no xenoma de E. coli”, continúa.
Os sistemas de ARN ponte atópanse en bacterias e arqueas, e os investigadores mostraron unha versión deste sistema in vitro e en células bacterianas. A súa posible aplicación en células e xenomas de mamíferos podería beneficiar a unha ampla gama de organismos utilizados en investigación e biotecnoloxía.
Propiedades deste novo método
Unha vantaxe potencial do ARN ponte é que pode realizar a recombinación sen necesidade dos mecanismos de reparación do ADN do hóspede, o que supoñería unha edición máis precisa. Tamén ten a capacidade única de recoñecer e manipular dúas secuencias de ADN simultaneamente, abrindo novas posibilidades que non son fáciles de conseguir cos sistemas CRISPR actuais.
“Estamos entusiasmados coas moitas aplicacións posibles que temos por diante”, sinala Hsu. “Por exemplo, algún día poderíanse modificar simultaneamente conxuntos enteiros de variantes xenéticas, o que permitiría investigar factores de risco polixénicos en lugar de cambiar variantes individuais dunha en unha”. Para Hsu, o ARN ponte tamén podería acelerar a enxeñería metabólica na bioloxía procariota inserindo vías encimáticas completas para producir compostos valiosos.
Da mesma forma, en terapia xénica e celular, este mecanismo facilitaría a inserción de grandes construcións xenéticas, como os receptores quiméricos de antíxenos para a inmunoterapia do cancro ou os xenes ausentes para a terapia xénica en rexións xenómicas específicas, e mellorar a eficacia e seguridade dos devanditos tratamentos. Tamén hai moitas aplicacións xenómicas funcionais, entre elas as posibilidades de enfermidades causadas por expansións repetidas ou translocacións xenéticas que poderían abordarse ao extirpar ou investir con precisión os segmentos de ADN problemáticos, o que permitiría aos científicos centrarse nas anomalías xenéticas.
Así funciona esta nova tecnoloxía
O sistema de recombinación ponte procede dos elementos da secuencia de inserción 110 (IS110), un dos innumerables tipos de elementos transponibles —ou ‘xenes saltóns’— que se cortan e pegan a si mesmos para moverse dentro dos xenomas microbianos e entre eles. Os elementos transpoñibles atópanse en todas as formas de vida e evolucionaron ata converterse en máquinas profesionais de manipulación do ADN para sobrevivir.
Os elementos IS110 son mínimos e constan unicamente dun xene que codifica o encima recombinasa e de segmentos de ADN franqueantes, que ata o de agora eran un misterio. O laboratorio de Hsu descubriu que cando o IS110 extírpase dun xenoma, os extremos do ADN non codificante únense para producir unha molécula de ARN —o ARN ponte— que se prega en dous bucles. Un deles únese ao propio elemento IS110, mentres que o outro se une ao ADN diana onde se inserirá o elemento.
O ARN ponte é o primeiro exemplo de molécula guía biespecífica, que establece a secuencia tanto do ADN diana como do doante mediante interaccións de apareamento de bases. Cada bucle do ARN ponte é programable de forma independente, o que permite aos investigadores mesturar e combinar calquera secuencia de ADN diana e doante do seu interese. Isto significa que o sistema pode ir moito máis alá da súa función natural de inserción do elemento IS110, permitindo a inserción de calquera carga xenética desexable —como unha copia funcional dun xene defectuoso causante dunha enfermidade— en calquera localización xenómica.
Pasos clave do proceso de recombinación
O descubrimento do laboratorio de Hsu compleméntase coa súa colaboración co grupo de Hiroshi Nishimasu, da Universidade de Tokio, cuxos resultados se publican nun segundo traballo en Nature. O equipo utilizou a criomicroscopía electrónica para determinar as estruturas moleculares do complexo ARN ponte da recombinasa unido ao ADN diana e ao doante, avanzando secuencialmente polos pasos clave do proceso de recombinación.
A idea é que o mecanismo ponte marque o comezo dunha terceira xeración de sistemas guiados por ARN, e vaia máis aló dos mecanismos de corte de ADN e ARN de CRISPR e ARN de interferencia (ARNi) para ofrecer un mecanismo unificado de reordenación programable do ADN. “Ata o de agora descoñecíase como a recombinasa IS110 e o ARN ponte traballan xuntos para mediar na recombinación do ADN”, apunta a SINC Nishimasu. “Para comprender este mecanismo sen precedentes, utilizamos a criomicroscopía electrónica para observar a estrutura atómica do complexo que inclúe a recombinasa IS110, o ARN ponte, o ADN doante e o ADN diana”.
A estrutura revelou o mecanismo detallado de como a encima IS110 e o ARN ponte recoñecen o ADN doante e o ADN diana, cortan as dúas cadeas de ADN, intercámbianas e religan, e despois cortan e intercambian as dúas cadeas de ADN restantes, completando a recombinación. “Esta información sobre o complexo IS110-ARN ponte pode utilizarse para deseñar este sistema e crear variantes máis eficaces que poidan funcionar en células humanas”, puntualiza o investigador.
Limitacións do artículo
Aínda que este novo descubrimento é prometedor, é importante sinalar que CRISPR foi optimizado durante máis dunha década por miles de laboratorios e empresas que investiron miles de millóns de dólares para permitir aplicacións terapéuticas.
“Este primeiro conxunto de artigos presenta un tipo de ARN guía mecanicamente novo e a primeira recombinasa de ADN guiada por ARN”, indica Hsu. “Para optimizar a edición de pontes e convertela nunha ferramenta útil, teremos que realizar estudos exhaustivos similares sobre o seu alcance, eficacia e posibles efectos non desexados en diferentes tipos de células e métodos de administración”.
Ademais, nestes traballos non se demostrou que o sistema IS110 funcione en células humanas. “Será importante investigar se pode utilizarse para aplicacións de enxeñería xenómica nelas. Ademais, atopamos encimas da familia IS110 con secuencias diversas noutras bacterias, o que fai interesante analizar as súas funcións e mecanismos”, conclúe Nishimasu.
Referencias:
- Bridge RNAs direct programmable recombination of target and donor DNA (Publicado en Nature)
- Structural mechanism of bridge RNA-guided recombination (Publicado en Nature)
