Únete á nosa canle de Whatsapp
As ferramentas CRISPR de edición xenética ofreceron múltiples probas da súa versatilidade desde que o seu uso empezou a xeneralizarse en 2013. Son case un comodín que pode usarse en calquera circunstancia na que haxa material xenético polo medio. O penúltimo dos retos é a actual crise sanitaria causada polo coronavirus SARS-CoV-2. Que poden achegar as ferramentas CRISPR para loitar contra a Covid-19?
As tesoiras programables CRISPR, unha nucleasa Cas (que habitualmente corta o ADN) guiada por unha pequena molécula de ARN (que lle di á proteína Cas onde ten que cortar), son extraordinariamente variables nas bacterias e arqueas das que proveñen. Tal variedade explica que se puideron identificar proteínas Cas con distintas propiedades e aplicacións, alén do arquetípico sistema CRISPR-Cas9 que é o que maioritariamente se utilizou en todo o mundo.
Existen unhas nucleasas Cas que non cortan o ADN senón o ARN, tamén guiadas por pequenas moléculas de ARN. Por exemplo, a proteína Cas13a, descrita en 2017 polo laboratorio de Feng Zhang do instituto BROAD do MIT en Boston (Estados Unidos). Estes investigadores descubriron que cando Cas13a atopaba o ARN complementario ao seu guía era capaz de cortalo. Inmediatamente toleaba e empezaba a cortar, inespecíficamente, o resto de ARN que estivese nese tubo de ensaio. Este aparente fracaso foi un acicate para Feng Zhang, capaz de converter este resultado inesperado nunha oportunidade para deseñar unha nova aplicación para estas ferramentas CRISPR: o diagnóstico.
As investigacións de Feng Zhang abriron o camiño para usar CRISPR como ferramenta de diagnóstico
Zhang incluíu no tubo de ensaio unhas pequenas moléculas de ARN sintético que tiñan un marcador fluorescente e un inhibidor desta fluorescencia en cada extremo. Inicialmente estas moléculas non brillaban (a presenza do inhibidor impedía ver a fluorescencia), pero tan pronto a Cas13a activada procedía a cortalas, o marcador fluorescente separábase do inhibidor e podía manifestar a súa luminosidade.
Isto só sucedía cando a Cas13a recoñecera previamente o ARN problema que quería detectarse, o que permitira que a Cas13a empezará a cortar, primeiro especificamente e logo indiscriminadamente. Este novo sistema para diagnosticar a presenza dun ARN determinado nunha mestura recibiu o nome de SHERLOCK, acrónimo suxestivo que xoga coa descrición da técnica en inglés.
A principios deste ano adaptouse SHERLOCK para que detecte o virus SARS-CoV-2, cuxo xenoma é unha molécula de ARN. O test é rápido (1 hora) e ten unha sensibilidade capaz de detectar ata 10 copias do virus por microlitro (unha millonésima de litro). De momento só está autorizado para o seu uso experimental. Ten pendente o proceso de validación e autorización pola FDA, antes de que poida ser usada en hospitais masivamente.
A técnica SHERLOCK pode detectar nunha hora o SARS-CoV-2 con gran sensibilidade
Un ‘detector’ de coronavirus
Outra das investigadoras claves no pequena pero intensa historia das ferramentas CRISPR describiu en 2018 un sistema alternativo de diagnóstico, baseado na nucleasa Cas12a. Esta proteína curta habitualmente ADN, guiada por unha molécula pequena de ARN (como a Cas9), pero, no laboratorio, unha vez atopa a súa secuencia diana tamén tolea e pode cortar outras moléculas de ADN de cadea sinxela, o cal permite imaxinar o uso de chivatos parecidos aos deseñados por Zhang, que poidan detectarse por luz ou por calquera outra reacción química ao ser cortados.
Ese sistema recibiu o nome de DETECTR (pronunciado en inglés como “detector”). Neste caso, o sistema de diagnóstico é un pouco máis complexo, pois para poder aplicalo na detección de coronavirus, cuxo xenoma é unha molécula de ARN, o primeiro que hai que facer é convertelo a ADN mediante un ciclo de transcriptasa inversa. Unha vez xa en formato ADN o xenoma do virus pode ser detectado co seu guía de ARN correspondente e, tras a activación específica da nucleasa Cas12a, prodúcese a resposta inespecífica que acaba producindo luz ou outra reacción química facilmente detectable.
Este é o novo sistema de diagnóstico, cunha sensibilidade similar a SHERLOCK, que acaba de ser publicado. De igual maneira ten pendente a súa autorización para poder usarse na clínica.
Carmen coñece a Sherlock
A penúltima novidade da tecnoloxía CRISPR para a detección do coronavirus SARS-CoV-2 (e de moitos outros virus) chámase CARMEN, outro acrónimo enxeñoso proposto por dous equipos do instituto BROAD en Boston (Estados Unidos), que decidiron combinar SHERLOCK coa tecnoloxía de microfluidos (nanopingas) nun chip que consegue realizar miles de reaccións de detección simultáneas. A versatilidade do novo sistema CARMEN permite desde detectar a presenza de centenares de virus distintos en diversos pacientes, á vez, ata diagnosticar a presenza do coronavirus causante da COVID-19 en máis de mil mostras clínicas, simultaneamente.
Pacman contra o SARS- CoV-2
Os sistemas CRISPR de edición xenética tamén poden usarse como arma para loitar contra a infección polo coronavirus. En 2018 identificouse unha nucleasa, Cas13d, que era capaz de cortar moléculas de ARN de forma específica, sen tolear despois, grazas á acción de pequenas guías de ARN que lle ditaban que moléculas de ARN debía cortar. Este ano, tras algunha proposta teórica ao respecto, uns investigadores conseguiron demostrar, en células humanas en cultivo, que a nucleasa Cas13d era capaz de atactar e degradar o xenoma do coronavirus, converténdose nunha tesoira curativa, que bautizaron co non menos suxestivo nome de PAC-MAN (lembrando o famoso xogo de computador que en España coñecemos como comecocos).
Recentemente, outro laboratorio logrou conter a aparente tolemia da nucleasa Cas13a, en células e en ratos, ao reportar que é posible usala tamén para que loite, corte e elimine o xenoma de virus ARN como o do coronavirus ou o da gripe. Naturalmente, son necesarias moitos máis experimentos para garantir a seguridade e a eficacia deste tratamento experimental. Estamos aínda lonxe de converter estes achados de laboratorio en aplicacións terapéuticas válidas para ser usadas en hospitais con pacientes da COVID-19, pero sen dúbida mostran un futuro esperanzador onde os sistemas CRISPR tamén poderían xogar un papel relevante na loita contra a Covid-19.
* Lluís Montoliu é investigador en Bioloxía Molecular e Celular do Centro Nacional de Biotecnoloxía do CSIC.
Cláusula de divulgación: Lluís Montoliu recibe fondos do Ministerio de Ciencia e Innovación e de proxectos europeos H2020.
